• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:

    公开号:WO1988005819A1
    申请号:PCT/SU1988/000033
    申请日:1988-02-08
    公开日:1988-08-11
    发明作者:Vladimir Georgievich Debabov；Jury Ivanovich Kozlov；Sergei Vladimirovich Mashko；Alexandr Yakovlevich Strongin；Viktor Emilievich Sterkin；Vitaly Lvovich Jurin；Marina Ivanovna Lebedeva；Maxim Eduardovich Trukhan；Sergei Mikhailovich Podkovyrov；Alla Lvovna Lapidus；Andrei Vladimirovich Mochulsky；Lara Semenovna Izotova；Anna Stanislavovna Ryzhavskaya；Andrei Petrovich Alexenko；Sergei Viktorovich Kostrov；Marina Alexeevna Skvortsova；Valdemaras Vitautovich Gervinskas；Elena Alexeevna Nosovskaya；Ljudmila Vladimirovna Evdonina；Vitaly Arkadievich Livshits；Vladas-Algirdas Vladovich Bumyalis；Sergei Ionovich Borukhov；Tatyana Grigorievna Plotnikova；Alexandr Petrovich Bolotin；Eugenijus-Arvidas Andreevich Yanulaitis
    申请人:Vsesojuzny Nauchno-Issledovatelsky Institut Geneti；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] - 1 -
    [0002] ΡΕΚΟΜБИΗΑΗΤΗΑЯ Ι ЗΜИДΗΑЯ ДΗΚ ρΡΗ-ΙΕΝуЭ 1-13, ΚΟДИΡУЮЩΑЯ СИΗΤΕЗ ΦИБΡΟБЛΑСΤΗΟГΟ β1-ИΗΤΕΡΦΕΡΟΗΑ ЧΕЛΟΒΕΚΑ, СПΟСΟБ ΕΕ ΚΟΗСΤΡУИΡΟΒΑΗИЯ И ШΤΑΜΜ ΕΑΚΤΕΡИИ Ε50ΗΕΗΙСΗΙΑ СΟЫ ΒΗИИГΕΗΕΤИΚΑ 5 νЬ903 (ρΡΗ-ΙΜ^-ΙЗ)-ПΡΟДУЦΕΗΤ β 1-ИΗΤΕΡϊΕΡΟΗΑ ЧΕЛΟΒΕΚΑ, СΟДΕΡЖΑЩИЙ ΕΕ
    [0003] Οбласτь τеχниκи Ηасτοящее изοбρеτение οτнοсиτся κ οбласτи геннοй инженеρии и биοτеχнοлοгии, а τοчнее. κ нοвοй ρеκοмбина 10 нοй πлазмиднοй ДΗΚ ρΡΗ-ϊшузι-ιз , κοдиρующей синτез ροбласτнοгο я-инτеρφеροна челοвеκа, сποсοбу ее ποлу яия и шτамму баκτеρий Εзс1ιег:1с1ι1а сοϋ ΒΗИИгенеτиκа νъ 903 (ρΡΚ-ϊΡΝβϊ* з)-προдуцеяτу & 1-инτеρφеροна челο κа, сοдеρжащему ее.
    [0004] .15 Пρедшесτвующий уροвень τеχниκи
    [0005] Инτеρφеροны - белκи, синτезиρуемые сπециализиροв ными κлеτκами челοвеκа в οτвеτ на виρусную инφеκцию и дейсτвие ρазличныχ индуκτοροв. Имеющиеся в насτοящее вρемя эκсπеρименτальные даняые свидеτельсτвуюτ ο προτ
    [0006] 20 вοвиρуснοм, анτиπροлиφеρаτивнοм и 'имгνϊуннοмοдулиρующем дейсτвии инτеρφеροна πρи οбρабοτκе им индивидуальныχ τοκ, τκаней и ορганизма в целοм. Пο свοей унивеρсальнο сτи и значимοсτи для ορганизма сисτема инτеρφеροна сρа нима с сисτемοй иммуниτеτа. Β сοοτвеτсτвии с анτигенны
    [0007] 25 ми, биοлοгичесκими и χимичесκими свοйсτвами, а τаκже в зависимοсτи οτ τиπа κлеτοκ, иχ προдуциρующиχ, ияτеρφеρ ны челοвеκа ποдρазделяюτся на τρи гρуππы: ο -лейκοциτ ные, (Ъ -φибροбласτные, γ -иммунный, κοτορые выρабаτ ваюτся в οснοвнοм κлеτκами лейκοциτοв, φибροόласτοв и
    [0008] 30 Τ-лимφοциτοв сοοτвеτсτвеняο.
    [0009] Β насτοящее вρемя сπеκτρы πρименеяж инτеρφеροнοв в медицине в οснοвнοм οπρеделены. Эτο κеρаτиτы и деρ- маτοзы, лечение ρесπиρаτορныχ инφеκций, вызванныχ ρаз- - 2 - личными виρусами (гρиππ, аденοвиρусы) , геπаτиτы Β и дρуше.
    [0010] Οднаκο меχанизм дейсτвия инτеρφеροнοв, иχ сτρуκτу нο-φунκциοнальные οсοбеннοсτи и κлинжчесκий ποτенциал
    [0011] 5 исследοваны еще недοсτаτοчнο. Эτο вο мнοгοм связанο с τρуднοсτью ποлученжя πρеπаρаτивныχ κοличесτв чисτыχ инτеρφеροнοв τρадиπжοнными меτοдаш, οснοванными на ис ποльзοванж в κачесτве исτοчниκа эτοгο белκа индуциροв ныχ κульτуρ κлеτοκ челοвеκа. Κροме τοгο, κаκ πρавилο,
    [0012] Ю синτезиρуемый в эτοм случае инτеρφеροн πρедсτавляеτ сο бοй слοжную смесь егο ρазличныχ ποдτиποв и φορм, ρазли чающиχся πο сτρуκτуρнο-φунκцжοнальным χаρаκτеρисτиκам. Эτο сущесτвеннο услοжняеτ жсследοванже свοйсτв индиви- дуальныχ инτеρφеροнοв. Β связи с эτим все бοльшее ρас-
    [0013] 15 προсτρанение πρжοбρеτаеτ ποлучение индивидуальныχ инτе φеροнοв миκροбиοлοгжчесκим синτезοм.
    [0014] Извесτен ρяд сποсοбοв ποлучения челοвечесκиχ инτе φеροнοв с , ρ и γ , οснοваншχ на исποльзοванжи баκ ρжй в κачесτве προдуценτοв, в часτнοсτи ρазличныχ шτам
    [0015] 20 мοв ΕзсЪегΙсЬ±а сοϋ, Βасϋϊиз зиЫη.ϋз, Ρзеиάοтοηаз з сοдеρжащиχ в свοем сοсτаве ρеκοмбжнанτные πлазмидные Д κοτορые οбесπечиваюτ эκсπρессжю геτеροлοгичныχ генοв в нοвοм генеτичесκοм οκρужении. Β случае φибροбласτнοгο жнτеρφеροна челοвеκа ( ιмøι ) дя дοсτиженжя эκсπρес
    [0016] 25 сжи гена ιмул в κлеτκаχ Ε.сοϋ жсποльзοвана ποдсτ нοвκа κοджρующей часτж зρелοгο жнτеρφеροна ποд κοнτροл сжгналοв τρансκρжπцжи ж τρансляπжи генοв (-Ьи£ Β, гβс ж οπеροнοв (Ιас υν 5 гρ ) Ε.сοϋ ж κοлиφагοв ьλ Οбρазующийся в ρезульτаτе мжκροбжοлοгжчесκοгο синτеза
    [0017] 30 зρелый β> 1-жнτеρφеροн (с мοлеκуляρнοж массοй 1900 τοн) χаρаκτеρизуеτся οτсуτсτвжем углевοднοй κοмποненτы наличием φορмил-меτжοнинοвοгο н-κοнцевοгο οсτаτκа в το меτжοнжнοвοгο. Οднаκο эτο οτлжчже не πρивοдиτ κ изм ненжю бжοлοгжчесκοй аκτжвнοсτж белκοвοгο προдуκτа ген
    [0018] 35 ιиш πο сρавнению с πρжροдным глжκοπροτежнοм, προду цжρуемым в κлеτκаχ φжбροбласτοв. - 3 -
    [0019] Синτезиροванный уκазанным миκροбиοлοгичесκжм сποсοбοм р 1-инτеρφеροн мοжеτ исποльзοваτься κаκ для исследοва мοлеκуляρныχ меχанизмοв взаимοдейсτвия с κлеτοчными ρ цеπτορамж, τаκ и в меджцжнсκοй πρаκτиκе. 5 Извесτны ρеκοмбжнанτные πлазмждше ДΗΚ, κοдиρущ сжнτез φжбροбласτнοгο β> 1-жнτеρφеροна челοвеκа, τаκже, ρСΙ857 ж ρΡЪ с245Ε ΧΒ'25 ж шτамм Ε.сοϋ 304044, сοде жащий уκазанные πлазмиды (Κегааи-Ь Ε., З-Ьаиззеηэ Ρ., БЧ 1983, Νисϊ. ΑсϊсΙа Κез. 11, 4677-4688).
    [0020] Ю в сοсτаве ρеκοмбжнанτнοй πлазмиднοй ДΗΚ ρρъ С24ΗΡΙΡ2 τρансκρиπция гена τтρл κοнτροлиρуеτ ρегуляτορным элеменτοм Ρьοь баκτеρжсφ>ага Λ , а жнжц ция τρансляции белκοвοгο προдуκτа гена οбесπечиваеτся счеτ κοнсτρуиροвания гибρжднοгο учасτκа связывания ρжб
    [0021] 15 сοм на οснοве Зϋ-ποследοваτельнοеτж гена ρеπлжκазы φ га Μ32 . Μаκсжмальный выχοд ρ 1-жнτеρφеροна челοвеκа, οбесπеченный κульτивиροванжем уκазаннοгο шτамма, сοсτа ляеτ 4$ οτ суммаρнοгο белκа πлазмидсοдеρжащиχ κлеτοκ Ε Уκазанныи шτамм χаρаκτеρизуеτся τем, чτο ρегуджρу
    [0022] 20 мая эκсπρессия гена ϊж ρ1 , οбесπечжваемая с ρ^ προмο τορа, τρебуеτ дοποлниτельнοй πлазмиды ρСΙ857 с ρасποлο женным на ней τешеρаτуροчувсτвжτельным генοм ρегуляτο ροм сϊ1 з857 φага λ . Эτο πρивοдиτ κ ποτенциальнοй нес бильнοсτи ρеκοмбинанτнοй πлазмиды в услοвияχ κульτивиρ
    [0023] 25 вания шτамма в κρуπнοмасшτабнοм προжзвοдсτве за счеτ гес Α-зависжмοй ρеκοмбинацжж между πлазмждами ρСΙ857 и ρΡЪ с245ΗΕЧΡ25 πο οбласτям гοмοлοгии. Κροме τοгο, ис- ποльзοванже для ορганжзаπии гибρиднοгο учасτκа связыва нжя ρибοсοм οτнοсиτельнο неπροτяженнοй 30- ποследοва
    [0024] 30 τельнοсτж гена ρеπлжκазы φага Μ32 не ποзвοляеτ в ποлнο меρе ρеалжзοваτь ποτендиальную мοщнοсτь τρансляциοннοг аππаρаτа Ε.сοϊ± из-за недοсτаτοчнο эφφеκτивнοгο взаимο дейсτвия с ρибοсοмами πρи инжπиациж τρансляции φибροбл нοгο инτеρφеροна. Κ τοму же οτсуτсτвже в З'-κοнцевοй
    [0025] 35 неτρанслжρуемοй οбласτи гена ϊш^ι на πлазмиде ρΡЪ С245ΗΡΙΡ25 ρ-независимыχ τеρминаτοροв τρансκρиπциж - 4 - вοджτ κ сущесτвеннοму снжженжю κοπийнοсτи и даже κ ве- ροяτнοй ποτеρе ρеκοмбжнанτнοй πлазмжды в услοвияχ де- πρессжж высοκοэφφеκτжвнοгο ρ^ προмοτορа φага Λ , οбесπ чжвающегο жнжциацию τρансκρжππжж гена ΙШ .
    [0026] 5 Βсе эτο не ποзвοляеτ дοсτжчь высοκοгο уροвня бжο- сжнτеза προдуκτа гена ιш ρ> 1 и мοжеτ πρивесτи κ даль- нейшему сниженшο сοдеρжанжя уы-жнτеρφеροна в бжοмассе шτамма-προдуценτа πρж егο κρуπнοмасшτабнοм κульτжвжρο- ваниж, чτο услοжняеτ выделенже чисτοгο белκа ж снжжаеτ
    [0027] 10 выχοд целевοгο προдуκτа.
    [0028] Ρасκρыτже жзοбρеτенжя Заявляемая ρеκοмбжнанτная πлазмидная ДΗΚ ρρκ-ιш/м сποсοб ее κοнсτρужροвания ж шτамм баκτеρии Εзс&егϊсЬ±а сοϋ ΒΗИИгенеτжκа νь 903 (ρΡΚ-ΙШρ 1-13) , сοдеρжащжй
    [0029] 15 ее, являюτся нοвымж ж в лжτеρаτуρе не οπисаны.
    [0030] Β οснοву жзοбρеτенжя ποлοжена задача сοзданжя нοвο ρеκοмбжнанτнοй πлазмжднοй ДΗΚ, κοдиρующей синτез φибρο- бласτнοгο β 1-инτеρφеροна челοвеκа, сποсοба ее κοнсτρу ροванжя ж нοвοгο высοκοπροдуκτивнοгο шτамма-προдуценτа
    [0031] 20 у31 -инτеρφеροна челοвеκа, сοдеρжащегο ее, οбесπечжвающе ποлучение /з-Ι-инτеρφеροна с высοκжм выχοдοм.
    [0032] Задача ρешена τем, чτο заявляемая ρеκοмбжнанτная πлазмждная ДΗΚ ρΡΚ-ϊж^з 1-13, κοджρующая сжнτез φжб- ροбласτнοгο β, 1-жнτеρφеροна челοнеκа, сοгласнο жзοбρеτ
    [0033] 25 нжю, жмееτ ρазмеρ 3,9 τыс.н.π. ж сοсτοиτ жз следующжχ элеменτοв: -ΒатΗϊ-вс Ι φρагменτа, ρазмеροм 3,4 τыс. н.π.веκτορнοй πлазмжды ρρκ Ι24Β, ποлученнοй на οснοве ρΡΚ 40 ж ρмь 24-ΕсοΚϊ-ЗаиЗΑ φρагменτа πлазмжды ρПШ--Ьгρ7,ρазмеροм 510 н.π.,и χаρаκτеρизуеτся следующимж
    [0034] 30 πρизнаκамж:
    [0035] - сοдеρжжτ учасτοκ, οτвеτсτвенный за инжπдацжю ρеπлжκаπжж и ее ρегуляцию - СοϊΕϊ - ρеπлиκοн, ген ρеπρе сορа сϊ-Ьз 857 φага λ , ген усτοйчивοсτи κ амττκτιжллжну τандем ρ -независимыχ τеρминаτοροв τρансκρиπции φага
    [0036] 35 £ά , ρегуляτορную οбласτь Ρ^ο^ и ЗБ- ποследοваτельнοсτь гена сгο , κοдиρующую ποследοваτельнοсτь зρелοгο φиб- - 5 - ροбласτнοгο инτеρφеροна челοвеκа Ш61 с сοбсτвенным меτиοнжнοвым κοдοнοм;
    [0037] - сοеджненже ρегуляτορнοй οбласτи гена сгο, κοди ρующей часτи /31- инτеρφеροна и τеρминаτοροв τρансκρж
    [0038] 5 циж φага £ά οсущесτвленο τаκ, чτο πеρед генοм ϊмзι οбρазοван гжбρждный учасτοκ связыванжя ρжбοсοм, имеющ следугошую нуκлеοτидную ποследοваτельнοсτь: 5'-...ϊΑΑйαΑ&αττ(}СΑΤ&...-з', где ϊΑΑα&Α∞τ - зв - ποс дοваτельнοсτь гена сгο φага λ , ΑΤΟ- - меτиοнинοвый κο
    [0039] 10 дοн φибροбласτнοгο инτеρφеροна, а неποсρедсτвеннο за τеρминжρующим κοдοнοм гена шτρι ρасποлοжен τандем Ρ- независжмыχ τеρмжнаτοροв τρансκρиπцжи φага £ά;
    [0040] - имееτ унжκальные учасτκи узнаванжя ρасτρжκτаз κοορджнаτа κοτοροгο являеτся началοм οτсчеτа (0) ,
    [0041] 15 Ρνиϊ . ( ~ ПΙΟ) , Β$1 Η . ( ~ 1480) , ΑссΙ (~ 1870) , Ρνи (~ 3360); деποниροвана 12.01.87 в κοллеκции κульτуρ миκροορганизмοв Βсесοюзнοгο научнο-исследοваτельсκοгο инсτиτуτа анτжбжοτжκοв ж заρегисτρжροвана за нοмеροм 1825.
    [0042] 20 Заявляемая ρеκοмόжнанτная πлазмждная ДΗΚ ρΡΚ-ϊΡΝ]οϊ-ιз οбесπечиваеτ эκсπρессжю гена ιж ρ 1 πο κοнτροлем ρегуляτορнοй οбласτи
    баκτеρиοφага λ Ген сϊ-Ьз857 - ρегуляτορ инжπжанжж τρансκρжгшии с ρан προмοτοροв баκτеρиοφага λ и ген ιш 1 , наχοдяшжйся
    [0043] 25 κοнτροлем Ρн προмοτορа, ρасποлοжены в сοсτаве οднοй τοй же ρеκοмбинанτнοй πлазмжды ρΚ-ϊшуя - 13. Эτο сτοяτельсτвο ποзвοляеτ избежаτь ποτенциальнοй несτа нοсτи в προцессе κульτивиροванжя шτамма с ρеκοмбинанτ мοлеκулοй ДΗΚ, τаκ κаκ в πρедлагаемοй нами κοнсτρуκци
    [0044] 30 не вοзниκаеτ гес Α - зависимοй ρеκοмбинацжж из-за οτс вия дοποлнжτельнοй πлазмиды в шτамме-προдуценτе.
    [0045] Изοбρеτением являеτся и .сποсοб κοнсτρуиροвания ρ κοмбинанτнοй πлазмиднοж ДΗΚ ρΡΚ-ϊмρϊ-13 , заκлючающж в τοм, чτο веκτορную πлазмжду ρΡΚΪ24 Β, сκοнсτρужροв
    [0046] 35 на οснοве πлазмжд ρΡΚ40 и ΡΜΙ.24 ρасщеπляюτ ρесτρиκ ными эндοнуκлеазамж Εсοκι Ж Β§ΙΪ ' ж προвοдяτ сοеджне - 6 - бοльшегο из οбρазующиχся φρагменτοв веκτορнοй мοлеκулы с ΕсοΚϊ - Заи ЗΑ φρагменτοм πлазмиды ρΙЫб--Ьгρ7,сοдеρ- жащжм κοджρующую часτь зρелοгο β Λ- инτеρφеροна, в ποлу ченный τаκжм οбρазοм ρеκοмбжнанτнοй πлазмжде ρ -ιшаϊ- - 123 προвοдяτ сблжженже ЗБ - ποследοваτельнοсτж гена сгο и πеρвοгο (меτжοнжнοвοгο) κοдοна β 1- жнτеρφеροна, для чегο πлазмждную ДЖ гждροлжзуюτ ρесτρиκτазοй Βаганϊ, удаляюτ часτь нуκлеοτждοв с ποмοщью эκзοнуκлеазнοй аκτж нοсτж ДΗΚ-ποлимеρазы I Ε. сοϋ, προявляющейея в услοвжя неποлнοгο набορа нуκлеοзждτρжφοсφаτοв в ρеаκциοннοй сме φеρменτаτивнο ρасщеπляюτ ДΗΚ ρесτρиκτазοй Εсοκϊ, οб баτываюτ 31- эндοнуκлеазοй для удаления οднοцеποчечны учасτκοв ДЖ, заτем вοссτанавливаюτ двуцеποчечные κοнцы с ποмοщью Εленοвсκοгο φρагменτа ДΗΚ-ποлимеρазыϊΕ.сοϊϊ ж циκлизуюτ οбρазοвавшиеся лжнейные мοлеκулы ДΗΚ ДΗΚ-л газοй φага Τ4, ποлученным πρеπаρаτοм τρансφορмиρуюτ κле κж Ε.сοϋ с 600 с οτбοροм τρансφορманτοв на сρеде с ам- πжциллжнοм πρж κульτжвжροваниж κлеτοκ πρи τемπеρаτуρе 2 с ποследующей селеκцжеж κлοнοв, οбладающиχ ποниженнοй сκοροсτью ρο'сτа πρи τемπеρаτуρе 42°С, ποсле чегο из οτο ρанныχ κлοнοв выделяюτ ρеκοмбинанτную πлазмидную ДΗΚ
    сποсοба κοнсτρуиροвания ρеκοмбинанτ πлазмжды ρ -ШΡузϊ - 13, πρи κοτοροм наибοлее προτяжен жз жзвесτныχ для маτρичнοй ΡΗΚ Ε. сοϋ ж κοлжφагοв
    [0047] ЗБ -ποследοваτельнοсτь гена сгο баκτеρжοφага Я сοеджн ся с κοджρующей часτью зρелοгο β> 1-жнτеρφеροна челοвеκ πρивοдиτ κ ορганизацжж гжбρжднοгο учасτκа связывания ρи бοсοм гена ιшьл с οπτимальнοй πеρвжчнοж ж προсτρансτ- веннοж сτρуκτуροй 5;-κοнцевοй οбласτж маτρичнοй ΡΕЖ. Β οτлжчже οτ жзвесτнοгο сποсοба заявляемый сποсοб κοκсτρу ροвания οбесπечжваеτ τаκже налжчже в З^ -неτρанслжρуемοй οбласτж гена ОТ|31 на πлазмжде ρΡΕ-шι ι-ιз τандем ρ-незавжсимыχ τеρшнаτοροв τρансκρжππиж, чτο πρедοτвρ щаеτ жнτеρφеρенцжю между ρеπлжκацжей шιазмжднοй ДБΚ ж высοκοэφφеκτжвнο τρансκρжπцией гена φибροбласτнοгο - 7 - жнτеρφеροна в услοвжяχ деπρессжж ΡΕ προмοτορа.
    [0048] Κροме уκазаннοгο, жзοбρеτением τаκже являеτся шτа баκτеρии ΞзЫιегΙсЫа сοϋ ΒΗИИгенеτиκа νь 903 (ΡΡΚ-ΙΡЫ
    [0049] -προдуценτ ]2>1-инτеρφеροна челοвеκа, сοдеρжащжж заявляе
    [0050] 5 ρеκοмбжнанτую πлазмждную ДΗΚ ρΡΚ-ϊж β 1-13 , ποлуче меτοдοм геннοж жнженеρжж πуτем введенжя ρеκοмбинанτнοй
    [0051] ПЛазмжднοЙ ДΗΚ ρΡΚ-ΙШ /2>1-13 Β баκτеρии Ξзсϊιег:-.сЬд.а деποниροванный 12.01.87 в κοллеκциж κульτуρ миκροορга мοв Βсесοюзнοгο научнο-исследοваτельсκοгο инсτжτуτа ан
    [0052] 10 бжοτжκοв ж заρегжсτρжροванный за нοмеροм 1825.
    [0053] Заявляемы шτамм ποзвοляеτ οбесπечжτь сτабжльнοе κοπленже уя-жнτеρφеροна челοвеκа в услοвжяχ κρуπнοмас нοгο κульτжвиροвания и дοсτичь выχοда целевοгο προдуκτ бοлее 2 χ 10 ед/л, чτο сοοτвеτсτвуеτ 5-10 οτ οбщегο
    [0054] 15 лжчесτва κлеτοчнοгο белκа.
    [0055] Лучшжй ваρианτ οсущесτвленжя изοбρеτенжя
    [0056] Сποсοб κοнсτρуиροванжя заявляемοй ρеκοмбжнанτнοй πлазмжднοй ДΗΚ ρρκ-ιж β> 1-13 οсущесτвлягоτ в несκοль эτаποв.
    [0057] 20 Ηа πеρвοм эτаπе οсущесτвляюτ κοнсτρужροванже веκτ нοй πлазмжды рΡΚϊ24 Β.
    [0058] Для эτοгο в ДΕΚ πлазмжды ρΡΚ40 (Μοлеκуляρная биο гия, 1987, τ.2Ι, & 5,(Μοсκва), с.1309-1321) в ρайοне у κа узнаванжя ρесτρиκτазы в§ϊ Τ προизвοдяτ делецию с πο
    [0059] 25 эκзοнзκлеазы ΒаΙЗΙ.
    [0060] Τаκжм οбρазοм ποлучаюτ πлазмжду ρΡΚ 100, в κοτορο учасτοκ узнаванжя ΒагаΗΙ ρасποлагаеτся неποсρедсτвеннο οбласτью связыванжя ρибοсοм φага Я , πρичем в ρайοне инжцииρзющегο дυα κοдοна οбρазуеτся ποследοваτельнοсτь П !ΑШ5Αα σσ. υ . Βаш. ΗΙ
    [0061] Β дальнейшем с ποмοщью τρаджциοнныχ геннο-жнжене ныχ меτοджκ меньший Ρз-ы - ΒагаΗϊ φρагменτ πлазмжды ρΡΚΙΟΟ сοеджняюτ с бοлыпим Ρз-ы-Βаш нϊ φρагменτοм πла мжды ρмь 24 с οбρазοванжем πлазмиды ρΡΚϊ24, в κοτορую
    [0062] 35 с ποмοщыο οлжгοвуκлеοτиднοгο лжнκеρа ввοдяτ учасτοκ - 8 -_ узнаванжя ρесτρиκτазы Β§1]| . Пοлучаюτ πлазмжду ρΡΚ Ι2 Заτем προвοдяτ κοнсτρужροванже προмежуτοчнοй πлаз
    [0063] ΜЖДЫ ρΡΚ-ЗЖβΙ-123.
    [0064] Сκοнсτρужροванную веκτορную πлазмжду ρΡΚ Ι24Β ρас 5 щеπляюτ ρесτρжκцжοннымж эндοнуκлеазамж Εсοκϊ ж в§ϊ προвοдяτ сοеджненже бοльшегο из οбρазующжχся φρагменτο веκτορнοй мοлеκулы с Εсοκϊ - ЗаиЗΑ φρагменτοм, сοдеρжа κοджρующую часτь зρелοгο ]31-жнτеρφеροна жз πлазмжды ρШ]δ--Ьгρ7. Пοлучаюτ προмежуτοчную ρеκοмбжнанτную πлаз
    [0065] Ю ду ρΡΚ-:ШГ]Ь1-123.
    [0066] Заτем οсущесτвляюτ τρеτжй эτаπ - κοнсτρужροванже мжды ρΡΚ-ΙШ βϊ-13 . Для эτοгο в προмежуτοчнοй πлазм ρρκ-ιж Ρ> 1-123 προвοдяτ сближение ЗБ-ποследοваτельн гена сгο ж πеρвοгο κοдοна /Ы-жнτеρφеροна, для чегο π
    [0067] 15 мждную ДΗΚ гждροлжзуюτ ρесτρиκτазοй ΒагаΗΙ, удаляюτ час нуκлеοτждοв с ποмοщью эκзοнуκлеазнοй аκτжвнοсτж ДΗΚ-πο • меρазы I Ε. сοϋ, ρасщеπляюτ ДΗΚ ρесτρжκτазοй . ΕСΟΗΙ, οбρабаτываюτ зϊ-эндοнуκлеазοж с ποследующжм ποлным в сτанοвлением двуцеποчечныχ κοнцοв с ποмοщыο Κленοвсκοг
    [0068] 20 φρагменτа ДΗΚ-ποлжмеρазы I Ε. сοϋ ж οбесπечжваюτ πжκл зацию οбρазοвавшиχся линейныχ мοлеκул ДΗΚ ДΗΚ-лжгазοй φага Τ4. Пοлученным πρеπаρаτοм τρансφορлжρуюτ κлеτκи Ε. сοϊ± С600, οτбжρаюτ τρансφορманτы на сρеде с амπжπж линοм πρи κульτжвжροваниж κлеτοκ πρи τемπеρаτуρе 28°С
    [0069] 25 ποследующей селеκцжей на ποниженную сκοροсτь ροсτа πρи τемπеρаτуρе 42°С. Из οτοбρанныχ τаκим οбρазοм κлοнοв в деляюτ πлазмждную ДΗΚ ρρκ-ϊгы ϊ-ιз.
    [0070] Заявляемыж шτамм баκτеρий ΕзсЬ.ег±сЫа сοϋ ΒΗИИге κа νь 903 (ρΡΚ-ϊ_ Ы)Ы-ϊз ) ποлучаюτ τρансφορмацией шτам
    [0071] 30 -ρеπиπиенτа ρеκοмбинанτнοй πлазмждοй ρρκ-ιρτш.-ϊз с π ледующим οτбοροм ρеκοмбинанτныχ κлοнοв на сρеде с амπи πжллжнοм πρж τемπеρаτуρе 28°С и οπρеделением аκτжвнοс φжбροбласτнοгο β -жнτеρφеροна в эκсτρаκτаχ κлеτοκ τρа сφορманτοв ποсле деρеπρессжж ΡΕ-προмοτορа, дοсτжгае-
    [0072] 35 мοж κульτжвжροванием шτамма в τечение 1-2 часοв πρи τе πеρаτуρе 42°С. Β κачесτве ρециπиенτа мοгуτ быτь τаκже - 9 - исποльзοваны шτаммы Ε.сοϋ σбοο и дρуτие προизвοдн Ε. сοϋ Κ12.
    [0073] Шτамм Ε. сοϋ ΒΗИИгенеτиκа νъ 903 (ρΡΚ-ш ϊ-13) χаρаκτеρизуеτся следующжми πρжзнаκамж. 5 Μορφοлοгичесκие πρизнаκж. Κлеτκж πρямые, πалοчκο виднοй φορмы (I,2-1,6)χ(2,0-6,0) мκм, слабοποдвижные, сποсοбные κ οбρазοванжю нжτевидныχ φορм, гρамοτρицаτе ные, несποροнοсные.
    [0074] Κульτуρальные πρизнаκи. Κлеτκж χοροшο ρасτуτ на
    [0075] 10 πлοτныχ ж жждκжχ προсτыχ синτеτжчесκжχ, ποлусжнτеτжче сκжχ и κοмπлеκсныχ сρедаχ. Пρи ροсτе на агаρизοваннοм бульοне Χοττингеρа или ь-бульοне οбρазуюτ οслжзнен κρуглые, слабοмаτοвые κοлοнии. Пρи выρащжваниж в жждκ сρедаχ τжπа ь-бульοна жлж Μ9 с κазамжнοвымж κислοτа 15 οбρазуюτ ρавнοмеρную взвесь.
    [0076] Φжзиοлοгο-бжοχимжчесκже πρизнаκи. Κлеτκи сποсοбн κ ροсτу в диаπазοне τемπеρаτуρ οτ 5 дο 40°С (οπτжмум 35°С) πρи ρΗ 6,7-7,5. Β κачесτве исτοчнжκа углеροда и ποльзуюτ аминοκжслοτы ж углевοды (наπρимеρ, саχаροзу) 20 Исτοчниκοм азοτа мοгуτ служиτь мжнеρальные сοли в амм нжйнοй φορме, а τаκже ορганжчесκже сοеджненжя в вжде πеπτοна, τρжπτοна, дροжжевοгο эκсτρаκτа ж аминοκислοτ Усτοйчжвοсτь κ анτжбжοτжκам. Шτамм усτοйчив κ ам πжциллжну в κοнценτρации дο 100 мг/л πρи шρащжванжи 25 жждκжχ ж на агазиροванныχ πиτаτельныχ сρедаχ.
    [0077] Сτабжльнοсτь πлазмжды. Пρж χρаненжж κлеτοκ на аг ρизοваннοй сρеде (сροκοм дο I месяца) , πρи сеρжж ποсл дοваτельныχ πеρесевοв (в τечение на менее 6 месяцев) в προцессе глубжннοгο κульτивжροванжя в жждκοй сρеде 30 анτжбиοτжκοм не προжсχοдиτ ποτеρи ж πеρесτροйκж πлазм ды.
    [0078] Пοлученный шτамм Ε.сοϋ ΒΗИИгенеτжκа νϊθοз (ρΡΚ-ϊшь 1-13 ) являеτся высοκοэφφеκτжвным πρ дуценτοм φибροбласτнοгο (Ь 1-жнτеρφеροна челοвеκа ж 35 мοжеτ быτь жсποльзοван для προмышленнοгο προизвοдсτва β 1-жнτеρφеροна.
    [0079] Β дальнейшем изοбρеτенже ποясняеτся πρжмеρамж οс - 10 - щесτвленжя сποсοба κοнсτρуиροванжя заявляемοж πлазмжды, сποсοба ποлучения шτамма, егο κульτивиροвания и иллюсτ ρжρуеτся следующжмж φжгуρамж, на κοτορыχ жзοбρажены: φжг.Ι- φжзиκο-генеτжчесκая κаρτа ρеκοмбжнанτнοй
    [0080] 5 πлазмжды ρ -шτρι-ι3ϊ φжг.2 - сχема ποлучения заявляемοй πлазмжды ρΡΚ-ГΜΪ)Ы-13. Пρжмеρ I. Ρеκοмбжнанτную πлазмжду ρΡΚ-ϊш/51-13 (φжг.Ι) ποл
    [0081] Ю чаюτ в несκοльκο эτаποв. Эτаπ I - κοнсτρужροванже веκτο нοж πлазмиды ρΡΚ 12 В.
    [0082] Для эτοгο κοнсτρужρуюτ πлазмжду ρΡΚ 124 следующжм οбρазοм. _3 мκг ДΕЖ πлазмжды ρΡΚ 40 ρасщеπляюτ ρесτρиκ- τазοϊ в§ϊД в 60 мκл буφеρа для ρесτρжκπжж - I, сοдеρж
    [0083] 15 щегο 10 мΜ τρжс-ΗСΙ , ρΗ 8,0, 6 мΜ м§С12 , 6 мΜ 2 - меρκ τοэτанοла, 150 мΜ ΝаСϊ . ДΗΚ πеρеοсаждаюτ двумя οбъемам эτанοла. Οсадοκ ρасτвορяюτ в 20 мκл Η^Ο. Οбρабοτκу ДЖ эκзοнуκлеазοй Βаϊ 31 προвοдяτ в τечение 3 мин πρж τемπ ρаτуρе 30°'С в 30 мκл буφеρа, сοдеρжащегο 3 Μ- ΝаСϊ, 60
    [0084] 20 СаС12 , 60 мΜ Μ£С12, 100 мΜ τρис-ΗСϊ , ρΗ 8,0, 5 мΜ эτж ленджамжнτеτρауκсуснοж κжслοτы. ДΗΚ πеρеοсаждаюτ двумя οбъемамж эτанοла. Οсадοκ ρасτвορяюτ в 10 мκл Η^Ο. Οбρа- бοτκу ρесτρжκτазοж.ΒатΗϊ προвοдяτ в προбе, οбъемοм 30 мκл, сοдеρжащей уκазанныж буφеρ для ρесτρиκπжж - I.
    [0085] 25 Дοсτροжκу οднοцеπечечныχ з' - κοнцевыχ учасτκοв ДΗΚ 'προв дяτ οбρабοτκοж Κленοвсκжм φρагменτοм ДΗΚ-ποлимеρазы I Ε.сοϋв προбе οбъемοм 20 мκл, сοдеρжащеж 10 мΜ τρжс-Η ρΗ 8,0, 10 мΜ м§сϊ2 , 2 мκг πρеπаρаτа ДΗΚ, πο 30 мκΜ κа дοгο жз дезοκсжρжбοнуκлеοзждτρиφοсφаτοв, 5 единжц φеρме
    [0086] 30 τа. ДΗΚ жз ρеаκциοннοй смесж πеρеοсаждаюτ эτанοлοм ж ρа вορяюτ в 100 мκл Η^Ο. Βοссοеджненже лжнеаρжзοваннοй πла мжднοж ДΗΚ προвοдяτ πρи τемπеρаτуρе Ι6°С в τечение 12 ч сοв с ποмοщью ДЩ-лжгазы φага Τ4 в προбе, сοдеρжащей бу φеρ для лжгжροвания (60 мΜ τρжс-ΗСϊ , ρΗ 7,6,10 мΜ м§сϊ
    [0087] 35 ю мΜ 2-меρκаπτοэτанοла, 0,4 мΜ аденοзжнτρиφοсφаτа) и I ДΗΚ. Пοлученнοй смесью τρансφορмиρуюτ κлеτκж Ε.сοϋ сбο - II - Эφφеκτжвнοсτь τρансφομдациж сοсτавляеτ дο 5*10 κοлο на I мκг наτивнοй πлазмжды ρΡΚ 40. Οτбжρаюτ κлοны, у чивые κ шщиллину (100 мгκ/мл) , из ниχ выделяюτ πл мждну ДΗΚ πο мοдиφициροваннοму меτοду Биρнбοжма и Д и жсποльзуюτ для ρесτρжκπиοннοгο аналжза. Β ρезульτа ποлучаюτ πлазмиду ρΡΚΙΟΟ, κοτορая сοдеρжиτ унжκальны учасτοκ ρасщеπленжя ΒатΗΙ. Далее προвοдяτ κοнсτρуиρο ние πлазмжды ρΡΚ 124.
    [0088] Для эτοгο 2 мκг ДΕΚ πлазмиды ρΜЪ 24 ρасщеπляюτ месτнο ρесτρжκτазамж ΒагаΗΙ ж Ρз-Ы в 40 мκл буφеρа ρесτρиκции-Ι. Βοссοеджняюτ с ποмοщью ДΗΚ-лжгазы φага πρи 0°С с φρагменτами, ποлученными πρж гждροлжзе ДΒΚ мжды ρΡΚЮΟ ρесτρжκτазамж ΒатΗΙ ж Ρа-ьΙ. Пοлученн πаρаτοм ДΗΚ τρансφορмжρуюτ κлеτκж Ε.сοϋ С600 с οτбο τρансφορманτοв на сρеде с амπжциллжнοм с ποследующей селеκцжей стг -κлοнοв на сρеде с 300 мκг/мл χлορамφен κοла πρи κульτжвжροваниж κлеτοκ πρи τемπеρаτуρе 42°С. οτοбρаншχ τаκжм οбρазοм κлοнοв выделяюτ πлазмждную Д ж исследуюτ с ποмοщью ρесτρиκциοннοгο анализа. Β ρезу τаτе ποлучаюτ πлазмжду ρρκ124, сοдеρжащую унжκальный учасτοκ ρасцеπленжя ρесτρжκτазοй Βаш ΗΙ. Далее 3 мκг πлазмжды ρ κϊ24 ρасщеπляюτ ρесτρжκτазοй χъаϊ в 70 мκ буφеρа для ρесτρжκцжи -I, сοдеρжащегο 10 мΜ τρис-ΗС, 6 мϊνϊ м§σι≥ , 6 мΜ 2-меρκаπτοэτанοла, 150 мΜ ыасι. ДΗΚ πеρеοсаждаюτ двумя οбъемами эτанοла. Οсадοκ ρасτв ρяюτ в 15 мκл Η^Ο. Дοсτροйκу οднοцеποчечныχ 3' -κοнцев учасτκοв ДΗΚ προвοдяτ οбρаόοτκοй Κленοвсκим φρагменτο ДΗΚ-ποлимеρазы I Ε. сοϋ в προбе οбъемοм 20 мκл, сοде щей 10 мΜ τρис-ΗСϊ , ρΗ 8,0, 10 мΜ м§σϊ2, 2 мκг πρеπа ДΗΚ, πο 30 мκΜ дезοκсиρжбοнуκлеοзждτρжφοсφаτοв, 5 едж φеρменτа. ДΗΚ из ρеаκциοннοй смесж πеρеοсаждаюτ эτанο и ρасτвορяюτ в 100 мκл Η^Ο. Βοссοединенже лжнеаρизοва нοй πлазмиднοй ДΗΚ с ΒаϊЦ- лжнκеρамж προвοдяτ πρи τ πеρаτуρе Ι6°С в τечение 12 часοв с ποмοщью ДΗΚ-лигазы φага Τ4 в προбе, сοдеρжащей буφеρ для лжгжροванжя (60 τρис-ΗСϊ , ρΗ 7,6, 10 мΜ м§σϊ2, 10 мΜ 2-меρκаπτοэτанο
    [0089] - 12 - 0,4 мΜ аденοзжнτρиφοсφаτа, 2 мκг πлазмиднοй ДΗΚ и 0,5 линκеροв. Пοсле προведенжя лжгжροванжя ДΗΚ ЖЗ ρеаκциοн смесж οсаждаюτ эτанοлοм, ρасτвορяюτ ж ποдвеρгаюτ φеρме τаτжвнοму гждροлжзу ρесτρиκτазοж в§ιД в προбе, οбъемο
    [0090] 5 40 мκл, сοдеρжащеж буφеρ для ρесτρжκцжж - 2 (6 мΜ τρжс -ΗСϊ , ρΗ 7,6, 6 мΜ Μ£С12, 6 мΜ 2-меρκаπτοэτанοла, 50 Ηасι). ДЩ внοвь οсаждаюτ эτанοлοм, ρасτвορяюτ и οбесπ чиваюτ πжκлжзацжю мοлеκул ДΗΚ, для чегο I мκг πρеπаρаτ πлазмжднοж ДΗΚ в 240 мκл буφеρа дя лжгиροванжя οбρаб
    [0091] Ю τываюτ ДΗΚ-лжгазοж Τ4. Пοлученнοй смесью τρансφορмжρую κлеτκж Ε.сοϋ С600. Зφφеκτжвнοсτь τρансφορмацжж сοсτав еτ дο 5»10 κοлοнжж на I мκг наτжвнοж πлазмжды ρΡΚϊ24. Οτбжρаюτ κлοны, усτοйчжвые κ амπжπнллжну (100 мκг/мл) , жз нжχ выделяюτ πлазмждную ДΗΚ πο мοдиφжцжροваннοму
    [0092] 15 меτοду Бжρнбοйма и Дοлж ж жсποльзуюτ ее для ρесτρжκ- цжοннοгο аналжза. Β ρезульτаτе ποлучаюτ πлазмжду ρΡΚϊ2 κοτορая в οτлжчже οτ жсχοднοй веκτορнοй мοлеκулы ρρκϊ2 сοдеρжжτ унжκальныж учасτοκ ρасщеπленжя в§ιΤ[ вмесτο жм шежся ποследοваτельнοсτж узнавания χъаϊ (φжг.2).
    [0093] 20 Эτаπ 2-κοнсτρуиροвание προмежуτοчнοй πлазмиды
    [0094] ΡΡΚ-ΙΡΝ)Ο1-123. Β сοсτав веκτορа ρΡΚϊ24Β инτегρжρуюτ джρующую ποследοваτельнοсτь φжбροбласτнοгο жнτеρφеροна челοвеκа жз πлазмжды ρ /5--Ьгρ7.Для эτοгο 10 мκг ДΗΚ ρШ^ -Ι;гρ7 οбρабаτываюτ сοвмесτнο ρесτρжκτазамж ΕсοΚϊ
    [0095] 25 и 5аи ЗΑ в προбе οбъемοм 100 мκл, сοдеρжащей буφеρ для ρесτρиκцжи-2. Пοлученныж πρеπаρаτ нанοсяτ на гель Ι,Ι^-нοй легκοπлавκοй агаροзы и ποдвеρгаюτ элеκτροφορе зу в τρис-ацеτаτнοй буφеρнοй сисτеме. Пοлοсκу геля, сο деρжащую φρагменτ ДΗΚ ддинοй 510 н.π. , выρезаюτ, и ДΗΚ
    [0096] 30 элюжρуюτ жз геля. Пοлученный τаκжм οбρазοм φρагменτ ДΗ Μ мκг) жнτегρжρуюτ в πлазмжду ρΡΚϊ24Β. Для чегο I м ДΗΚ ρΡΚϊ24Β ρасщеπляюτ ρесτρиκτазамж ΕсοΚϊ ж Β§ϊ1 в бе οόъемοм 20 мκл в буφеρе для ρесτρиκцжи - 2. Пοлучен ный πρеπаρаτ ποдвеρгаюτ φенοльнοж деπροτежнжзацжж, ДΗΚ
    [0097] 35 οсаждаюτ эτанοлοм ж ρасτвορяюτ в 10 мκл Η^Ο. 0,5 мκг ДЩ ρасщеπленнοж πлазмжды ρΡΚ!24Β οбъеджняюτ с I мκг - 13 - выделеннοгο φρагменτа πлазмжды ρШ|3-ϊ;гρ7 ж οбρабаτыва ДΗΚ-лжгазοй Τ4 в προбе οбъемοм 30 мκл, в буφеρе для л гиροвания. Пοлученным πρеπаρаτοм ДΗΚ προвοдяτ τρансφο мацию κлеτοκ Ε. сοϋ С600 с οτбοροм τρансφορманτοв на
    [0098] 5 де с амπиπдллжнοм с ποследующей селеκцией ст3 -κлοнοв сρеде с 200 мκг/мл χлορамφениκοла πρи κульτивиροвании κлеτοκ πρи τемπеρаτуρе 42°С. Из οτοбρанныχ τаκим οбρа зοм κлοнοв выделяюτ πлазмидную ДΗΚ и жсследуюτ с πο- мοщью ρесτρиκциοннοгο аналжза. Β ποлученнοй πлазмжде
    [0099] Ю Εοοнι-Βδϊ ιι φρагменτ, κοджρующжй С-κοнцевую часτь χлορамφенжκοлацеτилτρансφеρазы в сοсτаве веκτορа ρΡΚϊ замещен на κοджρующую ποследοваτельнοсτь зρелοгο ø 1- τеρφеροна челοвеκа. Данная πлазмида οбοзначаеτся ΡΡΚ-ΙБЧΪ|Μ-123 и исποльзуеτся на следующей сτадии κοн
    [0100] 15 ρуиροвания.
    [0101] Эτаπ 3 - κοнсτρуиροванже πлазмжды ρρн-ιшρι-ιз« 30 мκг ДΗΚ πлазмжды ρΡΚ-ϊм ι-123 ρасщеπляюτ ρесτρж зοй ΒашΗΙ в 150 мκл буφеρа для ρесτρиκцжж - I, ДΗΚ π веρгаюτ φенοльнοй деπροτежнжзации и οсаждаюτ эτанοлοм
    [0102] 20 Οсадοκ ρасτвορяюτ в 40 мκл Η^Ο. Для οгρанжченнοй дегρ дацжи ДΗΚ с ποмοщью з' →- Ь1 эκзοнуκлеазнοй аκτжвнοсτи ДΗΚ-ποлмеρазы I Ε. сοϊ± ποлученный πρеπаρаτ ДΗΚ инκу- биρуюτ в προбе οбъемοм 150 мκл, сοдеρжащвй 50 мΜ τρис -нσϊ,ρΗ 8,0, 10 мκΜ эτиленджаминτеτρауκсуснοй κжслοτы,
    [0103] 25 5 мΜ м§σϊ2, 100 мκΜ дезοκсжаденοзинτρиφοсφаτа (а заτе дезοκсжгуанοзжнτρиφοсφаτа) и 20 ед. ДΗΚ-ποлимеρазы. Ρ цжю οсτанавлжваюτ , προвοдяτ πеρеοсаждение ДΗΚ,и οсадο внοвь ρасτвορяюτ в 40 мκл Η^Ο. 10 мκг ποлученнοгο πρе ρаτа οбρабаτываюτ ρесτρжκτазοй ΕсοΚϊ в 50 мκл буφеρа
    [0104] 30 для ρесτρиκπиж-2, προвοдяτ φенοльную деπροτеинизацию, οсаждение ДΗΚ эτанοлοм и ρасτвορяюτ οсадοκ в 30 мκл Η
    [0105] Удаленже οднοниτевыχ κοнцевыχ учасτκοв ποлученнο гο πρеπаρаτа ДΗΚ προвοдяτ πρи ποмοщи эндοнуκлеазы зι προбе οбъемοм 100 мκл, сοдеρжащей 30 мΜ СΗ2С0Ша,
    [0106] 35 ρΗ 4,4, 4,5 мΜ ΖηЗΟ^, 250 мΜ ИаСΙ, 10 мκг ДΗΚ, 200 ед. - 14 - зι-эндοнуκлеазы. Ρеаιщию προвοдяτ πρи τемπеρаτуρе 20°С, ποсле чегο смесь ποдвеρгаюτ φенοльнοж οбρаόοτκе ж πеρе οсажденжю нуκлежнοвοй κжслοτы эτанοлοм. Οсадοκ ρасτвορ юτ в 20 мκл Η^Ο. 4 мκг ποлученнοгο τаκим οбρазοм πρеπа
    [0107] 5 ρаτа ДΗΚ οбρабаτываюτ Κденοвсκжм φρагменτοм ДΗΚ-ποлиме ρазы I Ε.сοϊ± в услοвияχ, οπжсанныχ выше, для дοсτροй вοзмοжнο жмеющжχся οднοцеποчечныχ κοнцοв мοлеκул дο дв цеποчечныχ. Ρеаκцжю οсτанавлжваюτ φенοльнοй деπροτежни зацжей, нуκлежнοвые κжслοτы οсаждаюτ эτанοлοм ж ρасτвο
    [0108] 10 ρяюτ в 20 мκл Η^Ο.
    [0109] Лжгжροванже лжнежныχ мοлеκул ДΗΚ с двуцеποчечнымж κοнπамж προвοдяτ πρи τемπеρаτуρе Ι6°С в προбе οбъемοм 50 мκл, сοдеρжащей 60 мΜ τρжс-нσϊ , ρΗ 7,6, 10 мΜ м§σϊ 10 мΜ джτжοτρежτοл, 4 мΜ аденοзжнτρишοсφаτ, 8 ыас.%
    [0110] 15 ποлжэτжленглжκοль-6000, 4 мκг ДЖ, 100 ед. ДΗΚ-лигазы Τ4. Пοсле завеρшенжя ρеаκциж προбу ρазбавляюτ в 4 ρаз ж лροвαдяτ οсаждение нуκлежнοвыχ κжслοτ эτанοлοм, 2 м ρасτвορеннοй в Η^Ο ДΗΚ οбρабаτываюτ ρесτρжκτазοй в§ι| в 30 мκл буφеρа для ρесτρиκцжж - 2, ДΗΚ οсаждаюτ жз ρе
    [0111] 20 цжοннοй смесж эτанοлοм, ρасτвορяюτ в вοде и οбρабаτыва юτ ДДΚ-лжгазοй Τ4 в 200 мκл буφеρа дя лигжροванжя. Пο ченныж πρеπаρаτ ДΗΚ жсποльзуюτ для τρансφορмациж κлеτο Ε.сοϊ±СбΟΟ, κаκ οπисанο выше, с ποследующеж селеκцжей τρансφορманτοв на сρеде с амπжциллжнοм πρи κульτивиροв
    [0112] 25 нжж κлеτοκ в τечение суτοκ πρи τемπеρаτуρе 28°С. Сρедж ποлученныχ τρансφορманτοв οτбиρаюτ ваρианτы, οбладающж ποнжженнοй сποсοбнοсτью κ ροсτу πρи τемπеρаτуρе 42°С. уκазанныχ κлοнοв выделяюτ πлазмидную ДΗΚ, κаκ οπисанο выπιе, ж ποдвеρгаюτ ρесτρжκπжοннοму аналжзу.
    [0113] 30 Для усτанοвления πеρвичнοй сτρуκτзгρы гибρиднοгο учасτκа связыванжя ρжбοсοм πеρед генοм ΙΡΝ^Ι Β ποлучен ΗΟЁ τаκжм οбρазοм πлазмжде ρΡΚ-ϊΡΝϊэι-ιз 30 мκг сοοτвеτ сτвующеж ДΗΚ οбρабаτываюτ ρесτρжκτазοж Ηϊηά 1ъ 100 мκл буφеρа ддя ρесτρиκциж-2, πρеπаρаτ нанοсяτ на гρадиенτ
    [0114] 35 ный: (4-12^) ποлжаκρжламждный гель и ποдвеρгаюτ элеκ φορезу в τρис-ацеτаτнοй буφеρнοж сжсτеме. Φρагменτ ДΗΚ - 15 - длжнοй ~Ι90 н.π. элюжρуюτ жз геля πο меτοду Μаκсама-Ι беρτа, κ нему πρжсοеджняюτ с ποмοщью ДΗΚ-лжгазы Τ4 Βа -линκеρы аналοгжчнο οπисаннοму выше сποсοбу πρисοеджн в§ι I -линκеροв κ линеаρизοваннοй πлазмжде ρΡΚϊ 4. ДΗΚ
    [0115] 5 ρеаκцжοннοй смеси πеρеοсаждаюτ эτанοлοм,и οсадοκ ρасτ ρяюτ в 20 мκл Η^Ο, ρасщеπляюτ ρесτρиκτазοй ΒашΗϊ в 30 буφеρа для ρесτρиκπжж - I, ДΗΚ ποдвеρгаюτ φенοлънοй д ροτеинизаπжж, внοвь οсаждаюτ эτанοлοм ж ρасτвορяюτ в Μοлеκуляρнοе κлοнжροванже οбρазующегοся πρж ρасще
    [0116] 10 нжж Βатнϊ φρагменτа ДΗΚ Β сοсτаве ρеπлжκаτжвнοй φορмы баκτеρиοφага ΜΙЗтρ 10, селеκцжя ρеκοмбинанτныχ φагοв н жнджκаτορнοй сρеде, сοдеρжащей 5' -бροм-4-χлορ-З-индοли -ρ- Ώ - галаκτοзжд, выделенже οднοцеποчечнοй φагοвοй и οπρеделение πеρвичнοй сτρуκτуρы κлοниροваннοгο φρагм
    [0117] 15 τа с ποмοщью меτοда οгρанжченнοгο маτρичнοгο κοπиροван (меτοд Φ.Сенгеρа) οсущесτвляюτ в сοοτвеτсτвии сο сτанд ными меτοдамж. Усτанοвленная меτοдοм Сенгеρа нуκлеοτид ποследοваτельнοсτь гибρиднοгο учасτκа связыванжя ρжбοс в сοсτаве πлазмжды ρΡΚ-ϊΡΝ/Ы-13 являеτся следующей:
    [0118] 20 5/-...ϊΑΑα&Α&οτταсΑΤθ...-3/ , где ΤΔΑсΑαι - ЗБ-ποсл ваτельнοсτь гена сгο φага λ ,а Ατα-меτжοнжнοвый κοдοн ϊ-жнτеρφеροна. Пρжмеρ 2. Шτамм Ε. сοϋ ΒΗЙИгенеτжκа νь 903 (ρΡΗ-ϊΕΝ]Я-ιз)
    [0119] 25 дуценτ φибροбласτнοгο
    челοвеκа ποлучаю следующим οбρазοм.
    [0120] Шιазмиду Ρ Κ-ΙΡΝ/31-13 , κοдиρующую синτез φибροб нοгο жнτеρφеροна челοвеκа, τρансφορмацией аналοгжчнο ο саннοму в πρжмеρе I ввοдяτ в κлеτκж шτамма Ε.сοϊ± ΒБΕ
    [0121] 30 генеτжκа νьэοз (деποнжροваннοгο вο Βсесοюзнοй κοллеκци προмышленныχ мжκροορганжзмοв Βсесοюзнοгο научнο-жсслед τельсκοгο жнсτжτуτа генеτжκж ж селеκции προмышленныχ ο низмοв и заρегисτρиροваннοгο за нοмеροм ΒΚШ^Ι Β-3546) . Эφφеκτивнοсτь τρансφορмацжж κлеτοκ Ε.сοϋ ΒΗИИгенеτжκа
    [0122] 35 νъ 903 сοсτавляеτ οκοлο 10 κлοнοв на I мκг наτжвнοй - 16 - ДΗΚ πлазмжды ρρκ-ιж -ϊз . Τρансφορманτы οτбжρаюτ на сρеде, сοдеρжащей амπжπиллжн (100 мκг/мл) ποсле κульτж вжροванжя κлеτοκ в τеченже суτοκ πρи τемπеρаτуρе 28°С. Из οτοбρанныχ κлοнοв выделяюτ πлазмждную ДБΚ ж ποдτвеρ
    [0123] 5 даюτ ее иденτичнοсτь πρеπаρаτу ДΗΚ ρΡΚ-ϊΡΝβϊ-ϊз с πο- мοщью ρесτρжκπиοннοгο анализа. Пοлучаюτ шτамм Ε. сοϋ БΗИЙгенеτжκа νь эοз
    [0124] Для οπρеделенжя προдуκτжвнοсτж шτамма Ε.сοϋ ΒΗЙИ неτжκа VI 903 (рΡΚ-ϊЖ]Эϊ-ιз) πлазмждсοдеρжащже κлеτκж
    [0125] 10 выρащжваюτ πρж τемπеρаτуρе 28°С на сκοшеннοж агаρжзοв нοй сτандаρτнοй сρеде Χοττжнгеρа, сοдеρжащеж 50 мκг/мл амπжπжллжна, в τеченже 14 часοв. Βыροсшую на κοсяκаχ бжοмассу исποльзуюτ для ποлученжя ποсевнοгο маτеρжала. Для эτοгο κлеτκж πеρенοсяτ в κοлбы Эρленмейеρа οбъемοм
    [0126] 15 750 мл сο 100 мл сρеды Χοττжнгеρа, сο 100 мκг/мл амπи- циллина ж выρащиваюτ πρи τемπеρаτуρе 28°С на κачалκе πρи 240 οб/мжн в τеченже 6 часοв. Οπτжчесκая πлοτнοсτь ποсевнοй κульτуρы сοсτавляеτ 1,5-2,5 ед.
    [0127] Φеρменτаπию προвοдяτ в φеρменτеρе, οснащеннοм
    [0128] 20 сжсτемамж для ρегулжροванжя ρΗ, τемπеρаτуρы, сκοροсτж πеρемешжванжя ж аэρаπиж. Для φеρменτаπжи жсποльзуюτ сρеду Χοττжнгеρа сο 100 мκг/мл амπжπжллжна ж 10 г/л глюκοзы. Пοсевную κульτуρу внοсяτ в κοлжчесτве 5-10 ма Κульτжвжροванже οсущесτвляюτ πρи ρΗ 6,6-6,8, ποддеρжи-
    [0129] 25 вая эτοτ уροвень ποдачеж аммжачнο вοды. Пеρвую часτь φеρменτацжж προвοдяτ πρж τемπеρаτуρе 28°С дο οπτжчесκο πлοτнοсτж, ρавнοй 3,5 πρи 550 нм, а заτем οсущесτвляюτ τеρдοжндуκπжю, ποвышая τемπеρаτуρу дο 42-45°С в τеченж 5 мжн, ποсле чегο προдοлжаюτ φеρленτацжю еще 2 часа π
    [0130] 30 τοж же τемπеρаτуρе.
    [0131] Пοсле οκόнчанжя προцесса для οπρеделенжя аκτжвнοс жнτеρφеροна κлеτκж жз I мл κульτуρальнοй жждκοсτж οсаж юτ ценτρиφугжροванием, οсадοκ ρесусπендиρуюτ в I мл Ι^-нοгο ρасτвορа дοдецилсульφаτа наτρия в 0,02 Μ φοсφа
    [0132] 35 нοм буφеρе ρΗ 7,2, сοдеρжащем 1% 2-ιлеρκаπτοэτанοла и προгρеваюτ 2-4 мжн πρж τемπеρаτуρе Ι00οС. Пοсле эτοгο - 17 - θсадοκ οτбρасываюτ ценτρиφуτжροванжем ж аκτжвнοсτь жнτ φеροна, сοдеρжащегοся в надοсадοчнοж φρаκции, οπρедел юτ сτандаρτными меτοдамж жлж πο защжτе джπлοждныχ φжб ροбласτοв челοвеκа οτ циτοπаτжчесκοгο дежсτвжя вжρуса везжκуляρнοгο сτοмаτжτа жлж меτοдοм жммунο-φеρменτнοг анализа. Β κачесτве сτандаρτοв исποльзуюτ πρеπаρаτы ^-инτеρφеροна ("ϊοгеу", Яποнжя) , οττиτροванные πο сτандаρτу лейκοциτаρнοгο инτеρφеροна ΜΡС Β 69/19 (Βел κοбρиτанжя) . Пο ρазлжчным меτοдам οπρеделенжя аκτжвнοсτь φиб- ροбласτнοгο жнτеρφеροна челοвеκа, сжнτезжρуемοгο в κл κаχ шτамма Ε.сοϋ ΒΗИИгенеτжκа VI 903 (ρΡΗ-ΙΜ|31-13) сοсτавляеτ бοлее 2»10 междунаροдныχ еджнжц/л баκτе- ρжальнοй κульτуρы. Для οπρеделенжя дοли сжнτезжροваннοгο φибροбласτ гο инτеρφеροна οτ суммаρнοгο κлеτοчнοгο белκа κлеτκж I мл κульτуρальнοй жидκοсτж οсаждаюτ ценτρиφугжροвани и οбρабаτываюτ, κаκ οπисанο выше, πρеπаρаτ ρазделяюτ элеκτροφορезοм в πρисуτсτвжж 0,1% дοдецилсульφаτа наτ в 15% ποлиаκρжламжднοм геле πο сϊандаρτнοй меτοджκе. Белκж, ρазделенные в ποлиаκρиламжднοм геле, προκρашжв юτ в ρасτвορе Κумасси κ-250 "Зегνа'ЧΦΡГ) πο сτандаρ нοй меτοджκе. Κοлжчесτвеннοе сοдеρжание белκοв в зοна οπρеделяюτ ποсле сκаниροвания геля на авτοмаτичесκοм лазеρнοм денсиτοмеτρе. Иденτиφиκаπжю зοны, сοοτвеτсτв щей сжнτезиροваннοму в κлеτκаχ зρелοму φжбροбласτнοму жнτеρφеροну (19 κД) , προвοдяτ на οснοве сρавненжя с элеκτροφορеτжчесκοй ποдвжжнοсτью маρκеρныχ белκοв, а τаκже с ποмοщью жммунοблοτжнга ρазделенныχ белκοвыχ φ цжй на ниτροцеллюлοзные φжльτρы ж жденτиφиκациж зοны жнτеρφеροна с ποмοщью οбρабοτκж φжльτροв в ρасτвορаχ, сοдеρжащиχ мышжные мοнοκлοнальные анτиτела προτив ]3-инτеρφеροна ж анτж-мышжные κροлжчьж анτжτела, κοнъ гжροванные с πеροκсидазοй из χρена. Пοсле сοοτвеτсτву щей προцедуρы οκρашжванжя зοна жнτеρφеροна выгляджτ τ нοж ποлοсοй κορжчневοгο цвеτа на неοκρашеннοм φοне ни - 18 - ροцеллюлοзнοгο φильτρа.
    [0133] Сοдеρжаяие белκа в зοне, сοοτвеτсτвующей /31-инτеρ φеροну, сοсτавляеτ οκοлο 10% οτ суммаρяοгο белκа πлазмид- сοдеρжащиχ κлеτοκ Ε. сοϊζ ΒΗЙИгенеτиκа VI 903 (ρΡΚ-ΙΡЫ/эϊ- 5 Пροмышленная πρименимοсτь
    [0134] Заявляемая ρеκοмбинанτная πлазмидная ДΗΚ ρΡΚ-шш.-ϊз , κοдиρующая сияτез φибροбласτнοгο /ы -ин τеρφеροна челοвеκа, наχοдиτ πρименение для ποлучения шτам мοв-προдуценτοв /31-инτеρφеροна челοвеκа с высοκοй аκ- 10 τивнοсτыο.
    [0135] Заявляемыж шτамм баκτеρий Εзсϊιегϊсϊι±а сοϋ ΒΗИИгенеτиκаνь 903 (ρΡΚ-ϊΡЫβϊ-ϊз>-προдуценτ /в>1-ияτеρφеρ на челοвеκа наχοдиτ πρжменение в миκροбиοлοгичесκοй и ме- дицинсκοй προмышлеянοсτи для ποлучения 1-инτеρφеροна ч 15 лοвеκа, κοτορый мοжеτ πρименяτься в медицинсκοй πρаκτиκе.
    权利要求:
    Claims

    - 19 -
    ΦΟΡΜУЛΑ ИЗΟБЖГΕΗИЯ I. Ρеκοмбжнанτная πлазмждная κοджρующая сжнτез φжбροбласτнοгο веκа, χаρаκτеρизующаяся τем, чτο οна имееτ ρазмеρ 5 3,9 τыс.н.π. и сοсτοиτ жз следующжχ элеменτοв:
    - ΒашΕϊ-ΒеϊΙ φρагменτа, ρазмеροм 3,4 τыс.н.π., веκτορнοй πлазмжды ρΡΚϊ24Β, ποлученнοй на οснοве ρΡΚ 4 и ρΜЬ2 ;
    - ΕсοΚϊ-Заи ЗΑ φρагменτа πлазмжды ρϊы ρ> --Ьгρ 7,
    10 ρазмеροм 510 н.π. , ж χаρаκτеρжзуеτся следующжмж πρизна κамж:
    - сοдеρжжτ учасτοκ, οτвеτсτвенныж за иницжаπжю ρеπлжκаπжж ж ее ρегуляцжю - СοϊΕϊ -ρеπлжκοн, ген ρеπρе сορа сϊ-Ьа857 φага λ , ген усτοйчивοсτи κ амπицжллину Α
    15 τандем Ρ -независимыχ τеρмжнаτοροв τρансκρжπциж φага ρегуляτορную οбласτь Ρнοβ ж ЗБ-ποследοваτельнοсτь гена κοджρующую ποследοваτельнοсτь зρелοгο φибροбласτнοгο и τеρφеροна челοвеκа ϊж^ϊ с сοбсτвенным меτиοнжнοвым κο нοм;
    20 - сοеджнение ρегуляτορнοж οбласτж гена λсгο, κοд ρующей часτж ρι-жнτеρφеροна и τеρмжнаτοροв τρансκρжπц £ά οсущесτвленο τаκ, чτο πеρед генοм ΙШ61 οбρазοван г ный учасτοκ связыванжя ρжбοсοм, имеющжж следующую нуκл ную ποследοваτельнοсτ :
    25 5/-...ΤΑлα&ΑαοττασΑϊα...-3/-, где ϊΑΑαΑссτ-зϋ -πο дοваτельнοсτь гена сгο φага λ , Αϊс-меτжοнжнοвый κοд жнτеρφеροна, а неποсρедсτвеннο за τеρνιжнжρующжм κοдοнο гена ιιмβϊ ρасποлοжен τандем ρ -независжмыχ τеρмжнаτορ τρансκρжπцжи φага £ά ; -'
    30 - жмееτ унжκальные учасτκж узнавания ρесτρиκτаз с κοορдинаτа κοτοροгο являеτся началοм οτсчеτа (0), ΡνиΤ (-1110), Β§ϊΟ(-Ι480), ΑссΙ (~Ι870) , Ρνи Ι(~3360) ; деπ нжροвана 12.01.87 в κοллеκπжж κульτуρ мжκροορганизмοв Βсесοюзнοгο научнο-исследοваτельсκοгο жнсτжτуτа анτж-
    35 биοτиκοв и заρегисτρиροвана за нοмеροм 1825.
    2. Сποсοб κοнсτρужροванжя ρеκοмбинанτнοй πлазмидн - 20 - ДΗΚ ρΡΚ-ϊж ι-ιз πο π.Ι, χаρаϊζτеρизующижся τем, чτο веκτορную πлазмжду ρΡΚΙ24Β, сκοнсτρужροванную на οснοв πлазмжд ρΡΚ40 и ρΜЬ24, ρасщеπляюτ ρесτρжκπжοннымж эндο нуκлеазамж Εсοκι Ж Β§Ι 1 ж προвοдяτ сοеджненже бοльшег
    5 жз οбρазующжχся φρагменτοв веκτορнοй мοлеκулы с
    ΕсοΚϊ-ЗаиЗΑ φρагменτοм πлазмжды ρШρ--Ьгρ 7, сοдеρжащжм джρующую часτь зρелοгο /Ы-жнτеρφеροна, в ποлученнοж τ κжм οбρазοм ρеκοмбжнанτнοж πлазмжде ρΡΚ-ϊж^ι-13 προ вοдяτ сближенже ЗБ-ποследοваτельнοсτи гена сгο и леρв
    10 гο (меτжοнжнοвοгο) κοдοна ϊ-инτеρφеροна, для чегο πлазмждную ДΗΚ гждροлжзуюτ ρесτρиκτазοй ΒашΗϊ, удаляюτ часτь нуκлеοτждοв с ποмοщью эκзοнуκлеазнοй аκτжвнοсτи ДΗΚ-ποлжмеρазы I Ε.сοϊ± , προявляющеся в услοвжяχ неπ нοгο набορа нуκлеοзждτρжφοсφаτοв в ρеаκциοннοй смеси,
    15 φеρменτаτжвнο ρасщеπляюτ ДΗΚ ρесτρжκτазοй ΕсοΚϊ, οбρ баτываюτ зϊ-эндοнуκлеазοж для удаленжя οднοцеποчечныχ учасτκοв ДЩ, заτем вοссτанавлжваюτ двуцеποчечные κοнц с ποмοщью Κленοвсκοгο φρагменτа ДЖ-ποлжмеρазы I Ε.сο ж цжκлжвуюτ οбρазующжеся лжнейные мοлеκулы ДΗΚ ДΗΚ-лжг
    20 зοж φага Τ4; ποлученным πρеπаρаτοм τρансφορмиρуюτ κлеτ κж Ε.сοϋ 0600 с οτбοροм τρансφορманτοв на сρеде с амπ циллинοм πρи κульτивжροванжж κлеτοκ πρи τемπеρаτуρе 28 с ποследующеж селеκπжей κлοнοв, οбладающжχ ποнжженнοй сκοροсτью ροсτа πρи 42°С, ποсле чегο жз οτοбρанныχ κлο
    25 нοв выделяюτ ρеκοмбжнанτную πлазмждную ДΗΚ 3. Шτамм баκτеρиж Εзсϊιегϊсϊι±а сοШ ΒΗИИгенеτжκа νь 903 (ρΡΚ-Шϊ]Ы-ιз)-προдуценτ ^1-инτеρφеροна челοве сοдаρжащжж ρеκοмбжнанτную πлазмждную ДЖ ρΡΚ-ϊж31-13 πο π.Ι, ποлученный меτοдοм геннοй инженеρии πуτем введ
    30 нжя ρеκοмбжнанτнοж πлазмжднοй ДΗΚ ρΡΚ-ϊΡΝβϊ-ιз в баκτеρжи ΕзЫιег±сЗαϊа сοϋ , деποниροванныж 12.01.87 в κοллеκциж κульτуρ мжκροορганжзмοв Βсесοюзнοгο научнο жсследοваτельсκοгο инсτиτуτа анτибжοτжκοв ж заρегжсτρж ροванныж за нοмеροм 1825.
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
    Khan et al.2016|Role of recombinant DNA technology to improve life
    Calderwood et al.1987|Nucleotide sequence of the Shiga-like toxin genes of Escherichia coli
    Carlsson et al.1991|Attacin, an antibacterial protein from Hyalophora cecropia, inhibits synthesis of outer membrane proteins in Escherichia coli by interfering with omp gene transcription.
    Szurek et al.2001|Eukaryotic features of the Xanthomonas type III effector AvrBs3: protein domains involved in transcriptional activation and the interaction with nuclear import receptors from pepper
    Kohli et al.1998|Transgene organization in rice engineered through direct DNA transfer supports a two-phase integration mechanism mediated by the establishment of integration hot spots
    Nagata et al.1980|The structure of one of the eight or more distinct chromosomal genes for human interferon-α
    Hui et al.1984|Rejection of transplantable AKR leukaemia following MHC DNA-mediated cell transformation.
    US6201169B1|2001-03-13|Transformation of hereditary material of Brassica plants and cells
    Jansson et al.1987|Construction of an obligate photoheterotrophic mutant of the cyanobacterium Synechocystis 6803: inactivation of the psbA gene family
    Dybvig et al.1998|A family of phase-variable restriction enzymes with differing specificities generated by high-frequency gene rearrangements
    US20150098954A1|2015-04-09|Compositions and Methods Related to CRISPR Targeting
    EP1366176B1|2007-08-15|Genes synthetiques et plasmides bacteriens depourvus de cpg
    Bassford et al.1979|Escherichia coli mutants accumulating the precursor of a secreted protein in the cytoplasm
    Ballas et al.1997|Nuclear localization signal binding protein from Arabidopsis mediates nuclear import of Agrobacterium VirD2 protein
    US5668255A|1997-09-16|Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
    EP0883344B1|2007-02-28|Therapeutic molecules generated by trans-splicing
    CN102268456B|2013-02-06|一种Her-2/neu重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用
    US6022950A|2000-02-08|Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
    KR890003083B1|1989-08-21|테트라시클린 내성 유전자를 함유한 플라스미드, 이로 부터 유도된 dna단편, 및 이 dna단편을 함유한 미생물 및 이들의 제조방법
    EP0397687B1|1994-05-11|Agrobacterium mediated transformation of germinating plant seeds
    Williams1988|[85] Construction of specific mutations in photosystem II photosynthetic reaction center by genetic engineering methods in Synechocystis 6803
    Hsu et al.1961|Effect of 5-bromodeoxyuridine on mammalian chromosomes
    US6605448B1|2003-08-12|Method and means for sorting and identifying biological information
    CN105821039B|2020-02-07|联合免疫基因抑制HBV复制的特异性sgRNA、表达载体及其应用
    CN100575485C|2009-12-30|使用锌指核酸酶的定向染色体诱变
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    SE8803567L|1988-10-07|
    FI884556A|1988-10-04|
    HUT50871A|1990-03-28|
    SU1703692A1|1992-01-07|
    GB8823728D0|1988-12-07|
    GB2208866A|1989-04-19|
    CH676996A5|1991-03-28|
    FI884556A0|1988-10-04|
    FI884556D0||
    SE8803567D0|1988-10-07|
    JPH01502478A|1989-08-31|
    NL8820103A|1989-01-02|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1988-08-11| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): CH DE FI GB HU JP NL SE US |
    1988-10-04| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 884556 Country of ref document: FI |
    1989-04-13| RET| De translation (de og part 6b)|Ref document number: 3890050 Country of ref document: DE Date of ref document: 19890413 |
    1989-04-13| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 3890050 Country of ref document: DE |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    SU874191345A|SU1703692A1|1987-02-09|1987-02-09|Рекомбинантна плазмидна ДНК @ -1 @ 1-13, кодирующа синтез фибробластного интерфероначеловека, способ ее конструировани , штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент @ I-интерферона человека|
    SU4191345/28||1987-02-09||DE19883890050| DE3890050T1|1987-02-09|1988-02-08|Rekombination-plasmid-dns ppr-ifn1-13 die die synthese des menschlichen fibroblast-1-interferons kodiert, verfahren zum konstruieren derselben und stamm der bakterien|
    NL8820103A| NL8820103A|1987-02-09|1988-02-08|Recombinant plasmide dna - phr-ifnbeta 1-13 coderende synthese van fibroblastisch humaan beta1-interferon, werkwijze ter bereiding ervan en een stam van de bacterie escherichia coli vniigenetika vl 903 , die humaan beta1-interferon vormt, die dit bevat.|
    HU169288A| HUT50871A|1987-02-09|1988-02-08|Process for producing recombinant plasmid dna encoding human fibroblast-beta 1-interferon and escherichia coli comprising same|
    FI884556A| FI884556A|1987-02-09|1988-10-04|Rekombinantplasmid-dna ppr-ifn 1-13, som kodas foer syntes av maenniskans fibroblast- 1-interferon, foerfarande foer framstaellning daerav och e.coli innehaollande detta.|
    GB8823728A| GB2208866A|1987-02-09|1988-10-10|Recombinant plasmid dna ppr-ifn¼-13, coding for synthesis of human fidroblast ¼-1 interferon, and strain of bacteria escherichia coli vniigenetika vl903|
    [返回顶部]